蛋白质生物学推介（三）

往期精彩：

补充一些有关酶的基础内容：

（聊生信：关于酶的内容太多了，还好大都比较有趣）

酶和底物之间的匹配需要非常精确。（利用）基因工程在酶的活性部位引入的一个小变化可以产生显著的影响。例如，用一种酶中的天冬氨酸代替谷氨酸，催化羧酸离子的位置只会移动1Å（大约一个氢原子的半径）。然而，这足以将酶的活性降低一千倍。

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Å：埃米（Ångstrom或ANG）是晶体学、原子物理、超显微结构等常用的长度单位，音译为"埃"，符号为Å，1Å等于1纳米的十分之一。

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酶的作用原理：1）增加催化部位底物分子的局部浓度；2）一些与底物的结合能直接有助于催化作用。

底物分子在形成最终反应产物之前，必须经过一系列几何结构和电子分布发生改变的中间状态。

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聊生信：分子自身时刻处于多种构象的高速动态变化之中，偶尔会出现偏离了其正常的、最稳定的构象，这种过渡态、特殊或中间构象会被酶巧妙地捕捉、稳定或利用。

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酶发挥催化功能的一般策略。在涉及两种或两种以上反应物的反应中，活性部位也起到模板或模子的作用，使底物基质（substrates）以适当的方向聚集在一起，以便在它们之间发生反应（下图A）。又如：溶菌酶中酶的活性部位包含精确定位的原子，这些原子通过使用带电基团改变底物中的电子分布来加速反应（下图B）。与酶的结合也会改变底物形状，弯曲其（化学）键，从而将底物“陷于”特定的过渡状态（下图C）。

酶催化的一般策略可大致分为三类：（A）将基底（substrates）精确对齐固定在一起；(B）反应中间体的电荷稳定；(C）改变基底中的键角以增加特定反应的速率。

最后，像溶菌酶一样，许多酶通过在底物和酶的侧链之间短暂形成共价键而密切参与反应。反应的后续步骤将侧链恢复到其原始状态，以便酶在反应后保持不变。

因此，酶的功能的发挥严重依赖于部分精确的蛋白结构和表面电荷分布。

多酶复合物有助于提高细胞代谢率

酶加速化学反应的效率对维持生命至关重要。实际上，细胞必须与不可避免的衰变过程相抗争，如果不加以注意，衰变过程会导致大分子朝着越来越大的无序方向下滑。如果理想反应的速率不大于竞争性副反应的速率，细胞很快就会死亡。

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通过测量ATP利用率，可以了解细胞代谢进行的速度。典型的哺乳动物细胞每1或2分钟“翻转”（“turns over”，例如：磷酸化的水解与恢复）其整个ATP池（ATP pool）一次。对于每一个细胞来说，这个周转率代表每秒大约一千万个ATP分子的利用率（或者对于人体来说，大约每分钟1克ATP）。

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由于酶催化的有效性，细胞内的反应速度很快。许多重要的酶已经变得如此高效，以至于没有进一步有效改进的可能性。限制反应速度的因素不再是酶的内在作用速度；相反，它是酶与其底物碰撞的频率。这种反应被称为扩散受限反应（diffusion-limited）。

如果酶催化的反应是扩散受限的，其速率取决于酶及其底物的浓度。如果一系列反应发生得非常迅速，那么每一种代谢中间体和相关酶都必须以高浓度存在。然而，考虑到一个细胞所进行的大量不同反应，所能达到的底物浓度是有限的。事实上，大多数代谢物的浓度为微摩尔级，大多数酶的浓度要低得多。因此，如何保持非常快的代谢率？

答案在于细胞组件的空间组织（spatial organization of cell components）。通过将反应序列中涉及的各种酶结合在一起形成称为多酶复合物的大型蛋白质组装体，可以在不提高底物浓度的情况下提高反应速率（如下图）。因为这允许酶A的产物直接传递给酶B，依此类推，所以扩散速率不需要限制，即使在整个细胞中底物的浓度非常低的情况下也是如此。因此，这类酶复合物非常普遍，几乎涉及代谢的所有方面，包括DNA、RNA和蛋白质合成的遗传中心法则（过程），这也许并不奇怪。

事实上，真核细胞中很少有酶可以在溶液中自由扩散；相反，大多数似乎已经进化出结合位点，将它们与其他具有相关功能的蛋白质集中在细胞的特定区域，从而提高它们催化反应的速率和效率。

丙酮酸脱氢酶的结构。这种酶的复合物催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A（acetyl CoA），这是将糖氧化为CO2和H2O的途径的一部分。这是一个大型多酶复合物的例子，反应中间体直接从一种酶传递到另一种酶。

真核细胞还有另一种增加代谢反应速率的方法，即利用细胞内的膜系统（intracellular membrane systems）。这些膜可以将特定的底物和作用于它们的酶分离到同一个膜封闭的腔室中，例如内质网或细胞核。例如，如果一个腔室占细胞总体积的10%，则该腔室中反应物的浓度可比没有腔室化的同一个细胞增加10倍之多。因此，原本受扩散速度限制的反应速度可以提高到原来的10倍。

酶的催化活性受到调控

整个细胞的酶促反应系统非常复杂，甚至如迷宫一般。因此需要详细、精确的控制来调节每个反应发生的时间和速度。

酶的基因表达、miRNA等介导的mRNA翻译抑制、靶蛋白水解等是酶的一些重要调节机制，但是调节反应速率的最快速、最普遍的过程是通过酶的活性对其遇到的特定分子的直接可逆变化来进行的。例如：酶的反馈抑制机制。在反应途径早期起作用的酶被该途径的后期产物抑制。因此，当大量最终产物开始积累时，该产物与第一种酶结合并减缓其催化作用，从而限制底物进一步进入该反应途径（如下图）。

单通路负反馈。最终产物Z抑制了第一种酶，这种酶是合成它所独有的，因此控制了它在细胞中的水平。

在路径分支或相交的地方，通常有多个由不同最终产物控制的点，每个点都起到调节自身合成的作用（如下图）。

多重负反馈。细菌中四种不同氨基酸的生物合成途径，红色箭头表示产品反馈抑制酶的位置。每个氨基酸控制着第一种特定于自身合成的酶，从而控制自身水平，避免中间产物的浪费。这些产物还可以单独抑制所有合成的初始反应。

反馈抑制几乎可以在瞬间起作用，并且在产物水平下降时迅速逆转。

另外，酶也可以受到正调控。例如，ADP的积累激活了参与糖分子氧化的几种酶，从而刺激细胞将更多的ADP转化为ATP。

变构酶有两个或多个相互作用的结合位点

调节分子（上述参与酶的正反馈与负反馈的分子）的形状通常与酶底物的形状完全不同。这是因为许多酶的表面必须至少有两个不同的结合位点：识别底物的活性位点和识别调节分子的调节位点。这两个位点必须以某种方式沟通，且相互影响。

目前已知，蛋白质分子上分开的位点之间的相互作用取决于蛋白质的构象变化：其中一个位点上的结合导致从一个折叠形状转变为稍微不同的折叠形状。例如，在反馈抑制期间，抑制剂在蛋白质的一个位点上的结合导致蛋白质转变为构象（conformation），在构象中其位于蛋白质其他部位的活性位点变得失能（incapacitated）。

人们认为大多数蛋白质分子是变构的。它们可以采用两种或两种以上稍有不同的构象，配体结合引起的构象变化可以改变它们的活性。这不仅适用于酶，也适用于许多其他蛋白质，包括受体、结构蛋白和运动蛋白。这些蛋白质的变构调节并不神秘：蛋白质的每个构象都有一些不同的表面轮廓，当蛋白质改变形状时，蛋白质与配体的结合位点也会改变。

此外，正如我们接下来讨论的那样，每一种配体都能稳定其结合最强的构象，因此（配体）在足够高的浓度下，往往会将蛋白质“切换”到它喜欢的构象。

两个结合位点偶联的配体必然相互影响对方的结合

配体结合对蛋白质的影响遵循一个基本的化学原理，即连接（linkage）。例如，假设一个结合葡萄糖的蛋白质也结合另一个分子X（在蛋白质表面的远处）。如果X的结合位点改变形状，作为葡萄糖结合引起的构象变化的一部分，则X和葡萄糖的结合位点称为偶联（coupled）。

当两个配体喜欢结合到变构蛋白质的同一种构象时，根据基本热力学原理，每个配体必须增加蛋白质对另一个的亲和力。因此，如果下图中的蛋白质转变为与葡萄糖结合最好的封闭构象，也会使X的结合位点更适合X，那么当X存在时，蛋白质与葡萄糖的结合会比没有X时更紧密。

由两个远处结合位点之间的构象耦合引起的正调控

如上图，葡萄糖和分子X与具有两个结构域的蛋白质的闭合构象结合得最好。因为葡萄糖和分子X都推动蛋白质走向闭合构象（closed conformation），所以每个配体都帮助另一个配体结合。葡萄糖和X分子因此被认为协同地结合在蛋白质上。

相反，如果两个配体倾向于结合到同一蛋白质的不同构象上，则连锁作用（linkage operates）就是负的。在这种情况下，第一配体的结合阻碍了第二配体的结合。因此，如果葡萄糖结合引起的形状变化降低了蛋白质对分子X的亲和力，那么X的结合也必须降低蛋白质对葡萄糖的亲和力（如下图）。连锁关系在数量上是相互的，因此，例如，如果葡萄糖对X的结合有很大的影响，那么X对葡萄糖的结合也有很大的影响。

由两个远处结合位点之间的构象耦合引起的负调控

这里的结构类似于前面的图，但是分子X倾向于开放的构象，而葡萄糖倾向于封闭的构象。因为葡萄糖和分子X驱动蛋白质走向相反的构象（分别是封闭和开放的），任何一个配体的存在都会干扰另一个配体的结合。

上面两个图所示的关系是所有细胞生物学的基础。由于这些示例中的分子X的结合位点不同于催化发生的位点，因此它不需要与葡萄糖或在活性位置结合的任何其他配体有化学关系。

正如我们刚才看到的，对于以这种方式调节的酶，分子X可以打开酶（正调节）或关闭酶（负调节）。通过这种机制，变构蛋白作为一般开关，原则上允许细胞中的一个分子影响任何其他分子的命运。

对称的蛋白质组装方式可产生协同的变构转变

受负反馈调节的单个亚基酶，当其结合的抑制性配体浓度增加100倍时，其活性最多可从90%下降到10%左右，这显然不够强烈，无法达到最佳的细胞调节，而且大多数由配体结合开启或关闭的酶都是由相同亚基的对称组合组成的。

通过这种排列方式，配体分子与亚基上的单个位点的结合可以触发亚基的变构变化，这种变化可以传递到邻近的亚基上，帮助它们结合同一配体。因此，发生了协同变构转变，允许细胞中配体浓度的相对较小的变化，将整个组装从几乎完全活跃的构象转换为几乎完全不活跃的构象（反之亦然）。

对于形成对称二聚体的酶来说，合作的“全有或全无”转变所涉及的原理最容易形象化。在图中抑制性配体的第一个分子很难结合，因为它的结合破坏了二聚体中两个相同单体之间在能量上有利的相互作用。然而，第二个抑制性配体分子现在更容易结合，因为它的结合恢复了对称二聚体的单体 - 单体接触。

对于形成对称二聚体的酶来说，合作的“全或无”（“all-or-none”）转变所涉及的原则是最容易想象的。在下图所示的例子中，抑制性配体的第一个分子很难结合，因为它的结合（需要）破坏二聚体中两个相同单体之间有利的能量相互作用。第二个抑制配体分子现在（变得）更容易结合，因为它的结合恢复了（结构稳定的）对称二聚体的单体-单体接触（monomer–monomer contacts），同时也将酶完全失活。（聊生信：这就实现了“all-or-none”，也帮助产生反馈的“阈值”）

变构酶由两个相同亚基组成的酶中的协同变构转变

上图说明了一个亚基的构象如何影响其相邻亚基的构象。抑制配体（黄色）的单个分子与酶的一个亚基结合是很困难的。然而，一旦发生了这种构象变化，通过恢复两个亚基之间的对称配对相互作用而获得的能量，使第二个亚基特别容易结合抑制配体并发生同样的构象变化。（最终）由于配体的第一个分子的结合增加了其他亚基结合同一配体的亲和力，酶对配体浓度变化的反应比只有一个亚基的酶的反应更剧烈。

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聊生信：因此当我们研究的蛋白的结构具有多个对称亚基的时候，可以推测这个蛋白的这种结构可能是为了更精准、快速地接受配体的正反馈（或者产物的负反馈）。我们也因此理解了为什么某些蛋白会具有多个对称的亚基，实在是一种“天才”的设计。

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更强烈的配体反应可以通过更大的（蛋白）组装得到，比如我们接下来讨论的（由）12条多肽链形成的酶。

天门冬氨酸转甲氨酰酶的变构转变的原子细节理解

在变构调节的早期研究中使用的一种酶是来自大肠杆菌的天冬氨酸转甲氨酰酶。它催化了开始合成C、U和T核苷酸嘧啶环的重要反应：氨甲酰磷酸+天冬氨酸→N-氨甲酰天冬氨酸。这一途径的最终产物之一，三磷酸胞嘧啶（CTP），会在CTP充足时与酶结合，使其关闭（实现负反馈）。

天冬氨酸转氨甲酰酶是由六个调节亚基和六个催化亚基组成的大型复合体。催化亚基以两个三聚体形式存在（下图中的蓝色部分），每个三聚体排列成等边三角形；两个三聚体彼此面对，并由三个调节性二聚体连接在一起（黄色），在它们之间形成桥梁。整个分子准备在两个构象之间进行协调一致的、全有或全无（all-or-none）的变构转换，称为 T（紧张）和 R（松弛）状态。

天冬氨酸转甲氨酰酶中R和T状态之间的转变

CTP 的结合导致两个结构域相对移动，因此它们的功能就像一个杠杆，可以旋转两个催化三聚体并将它们拉得更近，进入T状态。当这种情况发生时，相对的催化亚基之间会形成氢键，这有助于扩大形成每个催化亚基内活性位点的裂缝，从而破坏底物的结合位点。添加大量底物会产生相反的效果，通过结合在每个催化亚基的裂缝中并反对上述构象变化，从而有利于R状态。R 和T之间的中间构象不稳定（聊生信：这是由“对称”结构所决定的），因此酶主要在其R和T形式之间来回移动，产生这两种物质的混合物，其比例取决于 CTP和底物的相对浓度。

天冬氨酸氨甲酰基酶催化亚基的部分开关

蛋白质的许多变化是由磷酸化驱动的

酶的调节不仅仅是小分子的结合。第二种真核细胞常用的调节蛋白质功能的方法是在其氨基酸侧链上共价添加一个磷酸基。

这种磷酸化可以通过两种重要的方式影响蛋白质：

首先，因为每个磷酸基都带有两个负电荷，（由）酶催化的一个磷酸基加到蛋白质上可以引起蛋白质的主要构象变化（聊生信：可见蛋白表面电荷的重要性！相关的分析方法请参考之前的推文：正常与突变蛋白三维结构模型的绘制与分析）。例如，吸引一簇带正电的氨基酸侧链。这反过来会影响配体在蛋白质表面其他地方的结合，通过变构效应改变蛋白质的活性。由第二种酶去除磷酸基使蛋白质恢复到原来的构象并恢复其最初的活性。

其次，附着的磷酸基可以形成结构的一部分，直接被其他蛋白质的结合位点识别。如前所述，某些被称为模块（modules）的小蛋白质结构域经常出现在较大的蛋白质中。大量的这些模块提供了结合位点，将它们的蛋白质附着在其他蛋白质分子中的磷酸化肽上。其中一个模块是SH2结构域，与一个包含磷酸化酪氨酸侧链的短肽序列相结合。其他几种类型的模块在特定的情况下识别磷酸化的丝氨酸或苏氨酸侧链。蛋白质磷酸化和去磷酸化在驱动蛋白质复合物的被调节的组装和拆卸中起着重要作用。

通过这种作用，可逆的蛋白质磷酸化控制了真核细胞中许多类型蛋白质的活性结构和细胞定位。事实上，这种调节非常广泛，以至于在一个典型的哺乳动物细胞中，大约10,000种蛋白质中，有三分之一以上被认为在任何一个特定时间都被磷酸化，其中许多含有不止一个磷酸（基团）。

正如预期的那样，从特定蛋白质中添加和移除磷酸基通常是对特定细胞状态变化的信号作出的反应。例如，当真核细胞分裂时发生的一系列复杂事件主要是以这种方式计时的，许多介导细胞-细胞相互作用的信号通过一系列蛋白质磷酸化事件从质膜传递到细胞核。

真核细胞含有大量的蛋白激酶和蛋白磷酸酶

蛋白质磷酸化涉及ATP分子的末端磷酸基团在酶催化下转移到蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链上的羟基。该反应由蛋白激酶催化，由于当 ATP 中的磷酸-磷酸键断裂产生ADP时会释放大量自由能，因此该反应基本上是单向的。磷酸盐去除或去磷酸化的逆反应由蛋白质磷酸酶催化。

细胞包含数百种不同的蛋白激酶，每一种都负责磷酸化不同的蛋白质或一组蛋白质。还有许多不同的蛋白磷酸酶；其中一些是高度特异性的，仅从一种或几种蛋白质中去除磷酸基团，而另一些则作用于广泛的蛋白质，并通过调节亚基靶向特定底物。蛋白质在任何时刻的磷酸化状态及其活性取决于修饰它的蛋白激酶和磷酸酶的相对活性。

蛋白质的磷酸化

在真核细胞中磷酸化蛋白质的蛋白激酶属于一个非常大的酶家族，它们共享250个氨基酸的催化（激酶）序列。不同的家族成员在激酶序列的两侧包含不同的氨基酸序列，并且通常有短的氨基酸序列插入到其内部的环中。

这些额外的氨基酸序列中的一些使每个激酶能够识别它（将要）磷酸化的特定蛋白质组，或与定位它（在细胞特定区域的）结构相结合。蛋白质的其他部分允许每一种酶的活动被严格地调控，因此它可以根据不同的特定信号来开启和关闭，如下所述。

这些额外的氨基酸序列中的一些使每种激酶能够识别它磷酸化的特定蛋白质组，或与将其定位在细胞特定区域的结构结合。蛋白质的其他部分允许严格调节每种酶的活性，因此它可以响应不同的特定信号而打开和关闭。

蛋白质激酶的三维结构

这个结构上有红色箭头，表示在蛋白激酶家族的一些成员中发现5-100个氨基酸的插入位点。这些插入位于酶表面的环（loop）中，在那里其他配体与蛋白质相互作用。因此，它们区分不同的激酶，并赋予它们与其他蛋白质不同的相互作用（聊生信：本系列文章的第一篇中，抗体也可以依靠loops识别抗原）。ATP（提供一个磷酸基团）和要被磷酸化的肽被控制在活性位点，在磷酸结合环（黄色）和催化环（橙色）之间延伸。

由四个结构域组成的蛋白质
在Src蛋白中，两个结构域形成一个蛋白激酶酶，而SH2和SH3结构域执行调节功能。（A）（蛋白质的）带状模型（ribbon model），红色为ATP底物。（B）间隔填充模型（spacing-filling model），红色为ATP底物。注意，结合ATP的位点位于形成激酶的两个结构域的交界面。

通过比较蛋白质家族不同成员之间氨基酸序列差异的数量，人们可以构建一棵“进化树”，该树被认为反映了产生该家族的基因重复和分歧的模式。具有相关功能的激酶通常位于树的附近分支。例如，参与磷酸化酪氨酸侧链的细胞信号传导的蛋白激酶都聚集在树的左上角。其他激酶显示磷酸化丝氨酸或苏氨酸侧链，许多被组织成簇，似乎反映了它们在跨膜信号转导、细胞内信号放大、细胞周期控制等方面的功能。

选定蛋白激酶的进化树（聊生信：没有获取到更加清晰的图片）

驱动磷酸化周期所需的能量来自ATP水解的自由能，每一次磷酸化消耗一个ATP分子。由于蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶的联合活动（combined activities），蛋白质上的磷酸基不断地翻转：被添加，然后去除。这样的磷酸化周期可能看起来很浪费，但它们对于让磷酸化蛋白质从一种状态快速切换到另一种状态很重要：循环越快，蛋白质分子群体的磷酸化状态在突然刺激下，改变磷酸化速率时的变化越快。

”我们终于领略了完一大半，

但好戏还在后头！”

撰写：宋红卫，叶明皓

校对：宋红卫

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